Medical Sciences Journal of Islamic Azad University

fa دستکاری ژنتیکی سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی مشتق از چربی با miR-34a Gene manipulation of human adipose-derived mesenchymal stem cells by miR-34a زيست شناسي مولكولي Molecular Biology بنيادي Basic سابقه و هدف: ژن تراپی ایمن و موثر به عنوان یکی از اهداف درمانی در بسیاری از بیماریها در نظر گرفته میشود. با توجه به نقش مهم سلولهای بنیادی در سل تراپی، این مطالعه با هدف تولید سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی انسان (hASC) با افزایش بیان miR-34a انجام شد. روش بررسی: توالی پیش ساز hsa-mir-34a  در وکتورPCDH  لنتی ویروس کلون شد. وکتور نوترکیب و دو وکتور کمکی یعنی psPAX و pMD2  با روش کلسیم فسفات به داخل HEK-293T  منتقل شدند. سوپ ویروسی جمع آوری و با اولترا سانتریفیوژ  تغلیظ شد. سلولهایHEK-293T ترانسدیوس شده در روز چهارم با فلوسایتومتری ارزیابی شدند. پس از تعیین غلظت ویروسی، سلولهای hASC با ویروسهای تغلیظ شده ترانسدیوس شدند. استخراج RNA و سنتز cDNA به منظور ارزیابی میزان بیان miR-34a با Real Time PCR انجام شد.    یافته ها: توالی پیش ساز hsa-mir-34a   کلون شده در وکتور PCDH با colony-PCR و DNA sequencing تائید شد. ترانسداکشن سلولهای HEK-293T و hASC  در زیر میکروسکوپ معکوس فلورسنت دار و فلوسایتومتری مورد تائید قرار گرفتند. ارزیابی میزان بیان miR-34a در سلولهای آلوده به ویروس نوترکیب نشان داد که نسبت بیان miR-34a در گروه تست به طور معنیداری بیشتر از گروه کنترل بود (001/0=P). نتیجه گیری: این مطالعه نشان دادکه از سیستمهای لنتیویروسها میتوان برای وارد کردن ژنهای خارجی نظیر miR-34a  به سلولها استفاده کرد. همچنین این مطالعه نشان داد که سلولهای بنیادی دستکاری شده ژنتیکی به عنوان delivery system برای انتقال miR-34a و یا هر ژن دیگری میتوانند استفاده شوند. Background: Safe and effective gene therapy is considered as one of the therapeutic goals in many diseases. Due to the important role of stem cells in cell therapy, this study aimed to produce human adipose-derived mesenchymal stem cells (hASCs) using the miR-34a overexpression. Materials and methods: The hsa-mir-34a precursor sequence was cloned into the PCDH lentiviral vector. The recombinant vector and two helper vectors, i.e. psPAX and pMD2, were transferred into HEK-293T cell line by calcium phosphate method. Viral supernatant was collected and concentrated by ultracentrifuge. On the fourth day, transduced HEK-293 T cells were analyzed by flowcytometry. After the determination of viral concentration, hASC cells were transduced with condensed viruses. RNA extraction and cDNA synthesis were performed in order to assess miR-34a expression level by Real Time PCR. Results: The hsa-mir-34a precursor sequence cloned into PCDH vector was confirmed by colony-PCR and DNA sequencing. Transduction of HEK-293T cells and hASCs were confirmed under fluorescent inverted microscope and flowcytometry. The assessment of miR-34a expression level in infected cells with recombinant virus showed that the expression ratio of miR-34a in the test group was significantly higher than the control group (P=0.001). Conclusion: This study showed that lentiviral systems can be used to insert actopic genes like miR-34a into cells. It also showed that genetically manipulated stem cells can be used as a delivery system to deliver miR-34a or other genes. سلولهای بنیادی , لنتی ویروس, ترنسداکشن, ترنسفکشن, HEK-293T , miR-34a Stem cells, Lentivirus, Transduction, Transfection, HEK-293T, miR-34a. 70 78 http://tmuj.iautmu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1243-1&slc_lang=fa&sid=1 Katayoun Bahman Soufiani کتایون بهمن صوفیانی k.bahman@modares.ac.ir 10031947532846009160 10031947532846009160 No PhD Candidate, Department of Immunology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran دانشجوی دکتری دانشگاه تربیت مدرس، گروه ایمنی شناسی پزشکی، دانشکده علوم پزشکی دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران Ali Akbar Pourfathollah علی اکبر پورفتح اله pourfa@modares.ac.ir 10031947532846009161 10031947532846009161 Yes Assistant Professor, Department of Immunology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran استاد دانشگاه تربیت مدرس، گروه ایمنی شناسی پزشکی، دانشکده علوم پزشکی دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران Mahin Nikougoftar Zarif مهین نیکو گفتار ظریف nikougoftar@ibto.ir 10031947532846009162 10031947532846009162 No Associate Professor, Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion Medicine, Tehran, Iran دانشیار سازمان انتقال خون ایران، گروه هماتولوری، موسسه آموزش عالی سازمان انتقال خون ایران، تهران، ایران Ehsan Arefian احسان عارفیان arefian@ut.ac.ir 10031947532846009163 10031947532846009163 No Assistant Professor, Molecular Virology Lab, Department of Microbiology, School of Biology, college of Science, University of Tehran, Tehran, Iran استادیار دانشگاه تهران، گروه میکروبشناسی، پردیس علوم پایه، دانشکده زیست شناسی، دانشگاه تهران، تهران، ایران