fa بررسی و مقایسه روش‌های مبتنی بر رسوب دهی و کروماتوگرافی تمایلی در تخلیص پروتئین نوترکیب استرپتوکیناز بيوتكنولوژي biotechnology تجربي Experimental <strong><span style="letter-spacing:-.3pt;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">سابقه و هدف</span></span></span><em><span style="letter-spacing:-.3pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">:</span></span></span></em></strong> <em><span style="letter-spacing:-.3pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">تخلیص پروتئین با بازده و خلوص بالا چالشی جدی در تهیه پروتئین های نوترکیب دارویی است. از بین استراتژی&shy;های تخلیص پروتئین هدف، روش&shy;های تخلیص بر پایه کروماتوگرافی تمایلی مانند </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.3pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">Ni-NTA</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.3pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> بسیار پرکاربرد و در عین حال هزینه&shy;بر هستند. روش&shy;های تخلیص مستقل از ستون، مانند استفاده از پروتئین های شبیه به الاستین (</span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.3pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">ELP</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.3pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">)، به عنوان روش&shy;های جایگزین در حال توسعه هستند. در این تحقیق، کارایی استفاده از رزین نیکل، </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.3pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">ELP</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.3pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> و ترکیب آنها (</span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.3pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">ELP/Ni-NTA</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.3pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">) در تخلیص پروتئین استرپتوکیناز مورد ارزیابی قرار گرفت</span></span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">. </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;"></span></span></em><br> <strong><span style="letter-spacing:-.3pt;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">روش بررسی</span></span></span></strong><em><span style="letter-spacing:-.3pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">:</span></span></span></em> <em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">ژن استرپتوکیناز توسط </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">PCR</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> تکثیر، در پلازمید</span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">pET21</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> کلون و به سلول</span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">E.coli-Rosetta </span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">&nbsp;ترانسفرم شد. پروتئین آن بیان و تخلیص شد سپس ماهیت و خلوص پروتئین به ترتیب توسط وسترن بلات و </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">SDS-PAGE</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> مورد ارزیابی قرار گرفت. بازده خالص سازی در هریک از روش های تخلیص با میکروبرادفورد محاسبه شد.</span></span></span></em>&nbsp; <em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.3pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;"></span></span></em><br> <strong><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">یافته</span></span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:14.0pt;">&shy;</span></span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">ها:</span></span></span></strong> <em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">بازده خالص سازی </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">ELP-SK-His</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> با استفاده از ستون </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">Ni-NTA</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> به مقدار </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">&micro;g/ml</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> 14</span></span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:Cambria,serif;"><span style="font-size:12.0pt;">&plusmn;</span></span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">108 و </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">ELP</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> به مقدار </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">&micro;g/ml</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> 16</span></span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:Cambria,serif;"><span style="font-size:12.0pt;">&plusmn;</span></span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">76و </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">ELP/Ni-NTA</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> به مقدار </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">&micro;g/ml</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> 11</span></span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:Cambria,serif;"><span style="font-size:12.0pt;">&plusmn;</span></span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">88 محاسبه شد. نتایج رنگ آمیزی و وسترن بلات نشان داد که کیفیت خلوص پروتئین خالص شده با </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">ELP/Ni-NTA</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> بیشر از روش </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">ELP</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> و </span></span></span></em><em><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-size:10.0pt;">Ni-NTA</span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> به تنهایی بود</span></span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">.</span></span></span></em><br> <strong><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">نتیجه</span></span><span style="font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">&shy;</span></span></span><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">گیری</span></span></strong><em><span style="font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">:</span></span></span></em> <em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">مطالعه حاضر نشان داد که ادغام روش&shy;های خالص سازی در یک مرحله می&shy;تواند باعث افزایش خلوص و بازده محصول نهایی در تولید پروتئین&shy;های نوترکیب دارویی شود</span></span></span></em><em><span style="letter-spacing:-.2pt;font-weight:normal;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;">.</span></span></span></em><span style="font-weight:normal;"><span style="font-family:B Koodak;"><span style="font-size:12.0pt;"></span></span></span> <strong>Background</strong>: Increase of protein purity is a serious challenge in the production of recombinant therapeutic proteins. For this purpose, several strategies have been employed to purify the target protein, among which the affinity chromatography-based purification methods and tagged proteins such as Ni-NTA are common and but costly. Therefore column-free purification techniques, such as using elastin-like proteins (ELPs), are being developed as alternative method. In present study, the efficacy of Ni-NTA, ELP, and the combined Ni-NTA/ELP was evaluated for purification of streptokinase as a model protein at lab scale.<br> <strong>Materials and methods</strong>: Streptokinase gene was amplified by PCR, cloned into pET21-ELP, and transformed into <em>E.coli</em> BL21 Rosetta cell. The expressed protein was then purified using the methods described above. The identity and purity of the protein were evaluated by western blot using Anti-His antibody and SDS-PAGE, respectively. The purification yield was also calculated for each method by micro-Bradford assay.<br> <strong>Results</strong>: The purification yield was calculated as 76 &plusmn; 16 &mu;g/ml in ELP precipitation, 108 &plusmn; 14 &mu;g/ml in Ni-NTA purification and 88 &plusmn; 11 &mu;g/ml in Ni-NTA/ELP combined method, respectively. The SDS-PAGE results showed that the purity of streptokinase purified by the combined method was higher than that of each method separately.<br> <strong>Conclusion</strong>: The present study showed that the integration of purification methods in one step can increase the purity and yield in purification process of recombinant therapeutic proteins. پلی پپتیدهای شبیه الاستین, تخلیص پروتئین, استرپتوکیناز, تخلیص مستقل از ستون ELP, Elastin like polypeptide, Protein purification, Column-free purification, Streptokinase 387 395 http://tmuj.iautmu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-632&slc_lang=fa&sid=1 Masoud Seyedinkhorasani مسعود سیدین خراسانی 10031947532846008973 10031947532846008973 No PhD Student of Pharmaceutical Biotecnology, Nano-biotechnology Department, Pasteur Institute of Iran (PII), Tehran, Iran دانشجوی دکتری تخصصی بیوتکنولوژی دارویی، انستیتو پاستور ایران، بخش نانوبیوتکنولوژی، تهران، ایران Malihe Keramati ملیحه کرامتی keramatim@pasteur.ac.ir 10031947532846008974 10031947532846008974 No Assistant Professor, PhD of Pharmaceutical Biotechnology, Nano-biotechnology Department, Pasteur Institute of Iran (PII), Tehran, Iran استادیار، دکتری تخصصی بیوتکنولوژی دارویی، انستیتو پاستور ایران، بخش نانوبیوتکنولوژی، تهران، ایران Reza Ahangari Cohan رضا آهنگری کهن 10031947532846008975 10031947532846008975 No Associate Professor, PhD of Pharmaceutical Biotechnology, Nano-biotechnology Department, Pasteur Institute of Iran (PII), Tehran, Iran دانشیار، دکتری تخصصی بیوتکنولوژی دارویی، انستیتو پاستور ایران، بخش نانوبیوتکنولوژی، تهران، ایران Farzin Roohvand فرزین روحوند 10031947532846008976 10031947532846008976 No Associate Professor, PhD of Medical Biotechnology, Virology Department, Pasteur Institute of Iran (PII), Tehran, Iran دانشیار، دکتری تخصصی بیوتکنولوژی پزشکی، انستیتو پاستور ایران، بخش ویروس شناسی، تهران، ایران Dariush Norouzian داریوش نوروزیان dnsa@pasteur.ac.ir 10031947532846008977 10031947532846008977 Yes Professor, PhD of Biochemistry, Nano-biotechnology Department, Pasteur Institute of Iran (PII), Tehran, Iran استاد، دکتری تخصصی بیوشیمی، انستیتو پاستور ایران، بخش نانوبیوتکنولوژی، تهران، ایران