fa طراحی استریپ تشخیصی با بکارگیری تکنیک هیبریدسازی کووالانت معکوس DNA برای تشخیص سریع دو موتاسیون رایج IVS-I-5 و IVS-I-110 بتاتالاسمی در ایران علوم تغذيه Nutrition Sciences <div style="text-align: right direction: rtl"> <span style="font-weight: bold">سابقه و هدف:</span> بتاتالاسمی یک اختلال اتوزومال مغلوب می باشد که در اکثر موارد بوسیله موتاسیون های نقطه ای در ژن بتا-گلوبین ایجاد می گردد. موتاسیون های IVS-I-5 و IVS-I-110 موتاسیون های شایع در میان جمعیت ایران بوده و حدود 12% از اختلالات بتاتالاسمی را شامل می شوند. در این مطالعه با طراحی استریپ، تکنیک هیبریدسازی معکوس نقطه ای RDB، به عنوان یک روش غیررادیواکتیو و سریع برای تشخیص این دو موتاسیون شایع ژن بتاگلوبین گسترش داده شد.<br><span style="font-weight: bold">روش بررسی:</span> پس از استخراج DNA ژنومی از خون کامل، واکنش PCR با پرایمرهای اختصاصی Forward و Reverse روی ناحیه ای از ژن بتا-گلوبین حاوی دو موتاسیون مورد نظر انجام گرفت. برای تهیه استریپ، پروپ اولیگونوکلئوتیدی بر روی غشاء نایلونی حاوی گروههای کربوکسی Biodyne C از طریق فعال سازی غشاء تثبیت گردید. عمل هیبریداسیون به همراه 10 میکرولیتر از محصول دناتوره نشاندار شده با DIG-11-dUTP در دمای °42 سانتیگراد به مدت یک ساعت انجام شد. به دنبال آن عمل بلاکینک غشاء با 0.1 BSA(Bovine serum albumin) درصد انجام و سپس با 5 یونیت آنتی بادی Anti DIG متصل به آلکالین فسفاتاز به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق مجاور گردید. ظهور رنگ با سوبسترای نمک نیتروبلوتترازولیوم (NBT/BCIP) به مدت 2 ساعت انجام گردید.<br><span style="font-weight: bold">یافته ها:</span> حضور یک توالی خاص DNA بوسیله ظهور یک لکه روی غشا شناسایی شد. افراد نرمال لکه ها را تنها در مقرهای تثبیت پروبهای طبیعی، افراد هتروزیگوت، یک لکه در مقر تثبیت پروب طبیعی و یک لکه در مقر تثبیت پروب موتانت، و افراد هموزیگوت تنها یک لکه در مقر تثبیت پروب موتانت نشان دادند.<br><span style="font-weight: bold">نتیجه گیری: </span>در این تحقیق یک استراتژی سریع و ساده به منظور تشخیص موتاسیون های متداول بتاتالاسمی ایران بر اساس PCR و بدنبال آن هیبریدسازی معکوس راه اندازی گردید.</div> <span style="font-weight: bold">Background: </span>Beta-thalassemia is an autosomal recessive disorder that most commonly caused by point mutations in the beta-globin gene. IVS-I-5 and IVS-I-110 are the most frequent mutations found among Iranians comprising 12% of all mutations. In this study, we develop the implementation of the reverse Dot-Blot (RDB) hybridization technique as a rapid and simple method for the detection of the two common mutations in the beta-globin gene. <br><span style="font-weight: bold">Materials and methods: </span>Total genomic DNA was extracted and PCR with specific primer (forward and reverse primer) was performed on region of beta-globin gene consisting the two mutations. Labeled dNTPs with DIG-II-dUTP were used in PCR mixture therefore PCR product contained DIG labeling formed. The oligonucleotide probe was immobilized onto a Biodyne C nylon membrane via activation membrane. The strips were hybridized with 10 microliters of denatured PCR product labeled to DIG at 42°C for 60 minutes. After blocking strip with the blocking buffer, the strip exposed to 5 unit anti-DIG antibody conjugates with alkaline phosphatase for 30 minutes at room temperature. The color detection was performed with nitroblue tetrazolium salt (NBT/BCIP) substrate for 120 minutes.<br><span style="font-weight: bold"> Results:</span> The presence of a particular DNA sequence was detected by the appearance of a dot on the membrane. Normal individuals (N/N) showed dots with each wild-type sequence but not with any mutant probe. Heterozygotic individuals showed the appearance of a single mutation dot in addition to all the normal dots and homozygous individuals revealed dots with each mutant probe but not with any wild-type sequence. <br><span style="font-weight: bold">Conclusion:</span> we described a rapid and simple strategy to detect beta-thalassemia mutations based on PCR followed by reverse Dot-Blot hybridization. استریپ، موتاسیون، بتاتالاسمی، هیبریدسازی نقطه ای معکوس Beta-thalassemia, Mutation, Strip, Reverse Dot-Blot hybridization. 79 84 http://tmuj.iautmu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-270&slc_lang=fa&sid=1 Hashemi M هاشمی مهرداد 10031947532846002094 10031947532846002094 No Nazemi A ناظمی علی 10031947532846002095 10031947532846002095 No Forouzandeh M فروزنده مهدی 10031947532846002096 10031947532846002096 Yes